Produkti

Proteomu mēroga fosforilācijas notikumu analīze joprojām ir liels analītisks izaicinājums proteīnu fosforilācijas tīklu milzīgās sarežģītības dēļ.Šajā darbā mēs novērtējam Lys-N, Lys-C un tripsīna komplementaritāti attiecībā uz to spēju dot ieguldījumu fosfoproteoma globālajā analīzē.Tika izmantota rafinēta zema pH spēcīgas katjonu apmaiņas versija, lai efektīvi atdalītu N-galā acetilētus, fosforilētus un nemodificētus peptīdus.Izmantojot trīs enzīmu kombināciju, no 1 mg proteīna var identificēt pavisam 5036 neliekus fosfopeptīdus ar viltus atklāšanas biežumu <1%.Mūsu dati atklāja, ka pārklāšanās starp fosfopeptīdu datu kopām, kas ģenerētas ar dažādām proteāzēm, bija nenozīmīga, turpretī tika konstatēts, ka pārklāšanās starp divām līdzīgi ģenerētajām triptisko datu kopām ir vismaz 4 reizes lielāka.Tādā veidā paralēla Lys-N un tripsīna izmantošana ļāva par 72% palielināt atklāto fosfopeptīdu skaitu, salīdzinot ar d tikai ar tripsīnu, turpretim tripsīna atkārtojuma eksperiments izraisīja tikai 25% pieaugumu.Tādējādi, koncentrējoties tikai uz tripsīna un Lys-N datiem, mēs identificējām 4671 nevajadzīgu fosfopeptīdu.Turpmāka atklāto vietu analīze parādīja, ka Lys-N un tripsīna datu kopas bija bagātinātas ar ievērojami atšķirīgiem fosforilācijas motīviem, kas vēl vairāk pierāda, ka daudzproteāžu pieejas ir ļoti vērtīgas fosfoproteomu analīzēs.