Produkti

Olbaltumvielu fosforilēšana regulē dažādas šūnu funkcijas un spēlē galveno lomu augu agrīnā attīstībā.Lai papildinātu un paplašinātu iepriekšējos pētījumus par proteīnu fosforilēšanos Arabidopsis stādos, mēs izmantojām alternatīvu pieeju, kas apvieno proteīnu ekstrakciju nedenaturējošos apstākļos ar imobilizētu metālu jonu afinitātes hromatogrāfiju (IMAC) neskartu fosfoproteīnu bagātināšanu rubisko noplicinātos ekstraktos, kam seko identifikācija. izmantojot divdimensiju gēla elektroforēzi (2-DE) un šķidruma hromatogrāfijas-tandēma masas spektrometriju (LC-MS/MS).Gēla tripsīna gremošana un atlasīto gēla plankumu analīze identificēja 144 fosforilētus peptīdus un atlikumus, no kuriem tikai 18 fosfopeptīdi un 8 fosfosīti tika atrasti PhosPhAt 4.0 un P3DB Arabidopsis thaliana fosforilācijas vietu datubāzēs.Vairāk nekā puse no 82 identificētajiem fosfoproteīniem bija iesaistīti ogļhidrātu metabolismā, fotosintēzē/elpošanā vai oksidatīvā stresa reakcijas mehānismā.Šķiet, ka neskartu fosfoproteīnu bagātināšana pirms 2-DE un LC-MS/MS uzlabo fosforilētā treonīna un tirozīna atlikumu noteikšanu, salīdzinot ar metodēm, kurās tiek izmantota peptīdu līmeņa bagātināšana, kas liecina, ka abas pieejas ir zināmā mērā komplementāras attiecībā uz fosforilēšanas vietas pārklājumu.Salīdzinot rezultātus jauniem stādiem ar tiem, kas iepriekš iegūti nobriedušām Arabidopsis lapām, tika identificēti pieci proteīni, kas šajos audos ir atšķirīgi fosforilēti, parādot šīs metodes potenciālu olbaltumvielu fosforilēšanās dinamikas pētīšanai augu attīstības laikā.