ziņas

IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozīds) ir β-galaktozidāzes substrāta analogs, kas ir ļoti inducējams.IPTG indukcijas rezultātā induktors var veidot kompleksu ar represora proteīnu, lai represora proteīna konformācija tiktu mainīta tā, ka to nevar apvienot ar mērķa gēnu, un mērķa gēns tiek ekspresēts efektīvi.Tātad, kā eksperimenta laikā būtu jānosaka IPTG koncentrācija?Vai jo lielāks, jo labāk?
Pirmkārt, sapratīsim IPTG indukcijas principu: E. coli laktozes operons (elements) satur trīs strukturālos gēnus Z, Y un A, kas kodē attiecīgi β-galaktozidāzi, permeāzi un acetiltransferāzi.lacZ hidrolizē laktozi par glikozi un galaktozi vai par allo-laktozi;lacY ļauj apkārtējā vidē esošajai laktozei iziet cauri šūnas membrānai un iekļūt šūnā;lacA pārnes acetilgrupu no acetil-CoA uz β-galaktozīdu, kas ietver toksiskā efekta noņemšanu.Turklāt ir darbības secība O, sākuma secība P un regulējošais gēns I. I gēna kods ir represora proteīns, kas var saistīties ar operatora sekvences pozīciju O, tādējādi operons (meta) tiek represēts un izslēgts.Ir arī saistīšanās vieta kataboliskā gēna aktivatora proteīna-CAP saistīšanās vietai augšpus iniciējošās sekvences P. P secība, O secība un CAP saistīšanās vieta kopā veido lac operona regulējošo reģionu.Trīs fermentu kodējošos gēnus regulē viens un tas pats regulējošais reģions, lai panāktu koordinētu gēnu produktu ekspresiju.

Ja nav laktozes, lac operons (meta) atrodas represijas stāvoklī.Šajā laikā lac represors, ko ekspresē I secība, ko kontrolē PI promotora secība, saistās ar O sekvenci, kas neļauj RNS polimerāzei piesaistīties P secībai un kavē transkripcijas iniciāciju;kad ir laktoze, var inducēt lac operonu (meta) Šajā operonu (meta) sistēmā īstais induktors nav pati laktoze.Laktoze nonāk šūnā, un to katalizē β-galaktozidāze, lai pārveidotu par alolaktozi.Pēdējā kā induktora molekula saistās ar represora proteīnu un maina proteīna konformāciju, kas noved pie represora proteīna disociācijas no O secības un transkripcijas.Izopropiltiogalaktozīdam (IPTG) ir tāda pati iedarbība kā allolaktozei.Tas ir ļoti spēcīgs induktors, kuru baktērijas nemetabolizē un ir ļoti stabils, tāpēc plaši izmanto laboratorijās.

Kā noteikt optimālo IPTG koncentrāciju?Kā piemēru ņemiet E. coli.
E. coli BL21 ģenētiski modificēts celms, kas satur pozitīvo rekombinanto pGEX (CGRP/msCT), tika inokulēts šķidrā LB barotnē, kas satur 50 μg·mL-1 Amp, un kultivēts nakti 37 °C temperatūrā.Iepriekš minētā kultūra tika inokulēta 10 pudelēs ar 50 ml svaigas LB šķidrās barotnes, kas satur 50 μg·mL-1 Amp, attiecībā 1:100 ekspansijas kultūrai, un, kad OD600 vērtība bija 0,6–0,8, IPTG tika pievienota galīgajai koncentrācijai.Tas ir 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1.Pēc indukcijas tajā pašā temperatūrā un tajā pašā laikā no tā tika ņemts 1 ml baktēriju šķīduma, un baktēriju šūnas tika savāktas ar centrifugēšanu un pakļautas SDS-PAGE, lai analizētu dažādu IPTG koncentrāciju ietekmi uz olbaltumvielu ekspresiju, un pēc tam. atlasiet IPTG koncentrāciju ar lielāko proteīna ekspresiju.
Pēc eksperimentiem tiks konstatēts, ka IPTG koncentrācija nav tik liela, cik iespējams.Tas ir tāpēc, ka IPTG ir noteikta toksicitāte baktērijām.Koncentrācijas pārsniegšana arī nogalinās šūnu;un vispārīgi runājot, mēs ceram, ka jo vairāk šķīstošā proteīna ekspresē šūnā, jo labāk, bet daudzos gadījumos, kad IPTG koncentrācija ir pārāk augsta, tiks izveidots liels iekļaušanas daudzums.Ķermenis, bet šķīstošo olbaltumvielu daudzums samazinājās.Tāpēc vispiemērotākā IPTG koncentrācija bieži vien nav lielāka, jo labāka, bet jo zemāka koncentrācija.
Ģenētiski modificētu celmu indukcijas un kultivēšanas mērķis ir palielināt mērķa proteīna ražu un samazināt izmaksas.Mērķa gēna ekspresiju ietekmē ne tikai paša celma faktori un ekspresijas plazmīda, bet arī citi ārējie apstākļi, piemēram, induktora koncentrācija, indukcijas temperatūra un indukcijas laiks.Tāpēc kopumā pirms nezināma proteīna ekspresijas un attīrīšanas vislabāk ir izpētīt indukcijas laiku, temperatūru un IPTG koncentrāciju, lai izvēlētos piemērotus apstākļus un iegūtu labākos eksperimentālos rezultātus.