Produkti

Jauns augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas tests glikoziltransferāzēm, pamatojoties uz derivatizāciju ar antranilskābi un fluorescences noteikšanu.

Testi tika izstrādāti, izmantojot unikālo 2-aminobenzoskābes (2AA; antranilskābe, AA) marķēšanas ķīmiju, lai mērītu gan β1-4 galaktoziltransferāzes (GalT-1), gan α2-6 sialiltransferāzes (ST-6) aktivitātes ar augstas veiktspējas šķidrumu. hromatogrāfija (HPLC) ar fluorescences noteikšanu (Anumula KR. 2006. Fluorescences atvasināšanas metožu sasniegumi glikoproteīna ogļhidrātu augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiskai analīzei. Anal Biochem. 350:1-23).N-acetilglikozamīns (GlcNAc) un N-acetillaktozamīns tika izmantoti kā akceptori, un uridīna difosfāts (UDP)-galaktoze un citidīna monofosfāts (CMP)-N-acetilneiramīnskābe (NANA) tika izmantoti attiecīgi kā donori GalT-1 un ST-6.Fermentatīvie produkti tika marķēti in situ ar AA un tika atdalīti no substrātiem uz TSKgel Amide 80 kolonnas, izmantojot normālās fāzes apstākļus.Enzīmu vienības tika noteiktas no pīķu laukumiem, salīdzinot ar vienlaikus atvasinātajiem standartiem Gal-β1-4GlcNAc un NANA-α2-6 Gal-β1-4GlcNAc.Tika noteikta linearitāte (laiks un enzīmu koncentrācija), precizitāte (iekšējais un starptests) un testu reproducējamība.Tika konstatēts, ka testi ir noderīgi fermentu aktivitāšu uzraudzībai izolācijas un attīrīšanas laikā.Pārbaudes bija ļoti jutīgas, un tās bija vienādas vai labākas par tradicionālajiem radioaktīvā cukura mērījumiem.Testa formātu var izmantot arī citu transferāžu aktivitātes mērīšanai ar nosacījumu, ka ogļhidrātu akceptoriem ir reducējošais gals marķēšanai.Izmantojot IgG, tika izstrādāts glikoproteīna akceptoru tests.IgG glikānu (divu antenu G0, G1, G2, mono- un disialilētu) atdalīšanai tika izstrādāta īsa HPLC profilēšanas metode, kas veicināja GalT-1 un ST-6 aktivitāšu ātru noteikšanu.Turklāt šai profilēšanas metodei vajadzētu izrādīties noderīgai, lai uzraudzītu IgG glikānu izmaiņas klīniskajos apstākļos.